La produzione di proteine ricombinanti è una biotecnologia fondamentale che introduce DNA ricombinante in cellule ospiti per produrre proteine in elevate rese. Attraverso questa tecnologia è possibile far esprimere ad un batterio una proteina umana, permettendo di farla produrre in grandi quantità dai batteri dai quali è possibile isolarla.
Fasi della produzione di proteine ricombinanti
Il processo di produzione segue passaggi standardizzati e rigorosi:
- Clonazione genetica: Dopo aver identificato il gene bersaglio, quest'ultimo viene inserito in un vettore di espressione plasmidico tramite endonucleasi e DNA ligasi, utilizzando la tecnologia del DNA ricombinante.
- Trasformazione e trasfezione: L'inserimento di DNA ricombinante nelle cellule ospiti, tra cui batteri, lieviti, insetti e cellule di mammifero, è chiamato trasformazione nel caso di lieviti e batteri. Per le cellule di insetto e di mammifero, si parla di trasfezione.
- Screening: Attraverso lo screening con antibiotici, verranno identificate le cellule ospiti che portano i geni marcatori di resistenza nel vettore.
- Espressione: Coltivare e selezionare le cellule ospiti in condizioni idonee, quali temperatura, valore del pH e livello di nutrienti, e ottimizzare tali condizioni.
- Produzione e purificazione: Rilasciare la proteina e procedere con la sua purificazione.
Trascrizione e Traduzione Step by Step
Tecniche di estrazione e purificazione
Per isolare la proteina bersaglio è necessario procedere alla frantumazione delle cellule, utilizzando metodi come cicli ripetuti di congelamento e scongelamento, trattamento a ultrasuoni, detergenti e infine la rimozione dei detriti cellulari tramite centrifugazione differenziale.
La purificazione delle proteine ricombinanti richiede spesso l'introduzione di "tag" (marcatori) che ne favoriscano la dissoluzione e l'isolamento:
| Metodo di Tag | Principio di funzionamento |
|---|---|
| His-Tag | Utilizza sei residui di istidina che si legano a supporti contenenti ioni metallici. |
| GST-Tag | Sfrutta la glutatione S-transferasi che si lega al glutatione fissato su resina. |
Analisi e caratterizzazione delle proteine
Una volta purificata, la proteina deve essere analizzata per verificarne concentrazione, purezza e attività biologica. Tra le tecniche più utilizzate troviamo:
Determinazione della concentrazione e purezza
- Test di Bradford: Sfrutta il viraggio di colore del Coomassie Brilliant Blue in presenza di proteine.
- Test BCA: Basato sulla riduzione del rame in ambiente alcalino, misurato tramite spettrofotometria.
- SDS-PAGE: Gel di poliacrilammide che separa le proteine in base al loro peso molecolare.
Analisi delle interazioni e struttura
Per indagare le interazioni proteina-proteina o proteina-DNA si utilizzano tecniche avanzate come:
- Western Blot: Per l'identificazione specifica di proteine tramite anticorpi.
- Co-immunoprecipitazione (Co-IP): Metodo classico per studiare le interazioni fisiologiche in cellule intatte.
- ChIP (Immunoprecipitazione della cromatina): Potente strumento per studiare le interazioni proteina-DNA.
- SPR e BLI: Tecnologie per l'analisi in tempo reale delle interazioni tra biomolecole.
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